實(shí)驗(yàn)原理

該染色項(xiàng)目是對(duì)骨和軟骨進(jìn)行染色以觀察脊椎動(dòng)物骨骼在生理和病理狀態(tài)下的改變，阿利新藍(lán)是一種含銅離子的苯二甲藍(lán)染料，一種陽(yáng)離子染料,與硫酸根和糖蛋白結(jié)合強(qiáng)烈，可將黏多糖染成藍(lán)色，在骨染色中把軟骨染成藍(lán)色。茜素紅是陰離子染料能與鈣結(jié)合形成紅色沉淀，在骨骼染色中可將鈣化的骨基質(zhì)染成紅色。    
實(shí)驗(yàn)步驟

1、樣本處死：將胎鼠浸入無(wú)水乙醇 20 分鐘，觀察至呼吸停止未見掙扎，取出。

2、剝皮：將標(biāo)本浸入 70 攝氏度熱水中水浴加熱 25 秒，觀察至標(biāo)本腫脹皮膚變白后，立即取出，浸入冷水或酒精，剝皮去內(nèi)臟。

3、標(biāo)本固定：把去皮后的標(biāo)本整理好姿勢(shì)，（若標(biāo)本脂肪過(guò)多，浸入 3% 重鉻酸鉀溶液中幾天，除去材料表面的臟物和脂肪粒塊。當(dāng)溶液變渾濁時(shí)即更換 C 新液，觀察至溶液不渾濁為止，取出用清水沖洗），再浸入 95% 乙醇中繼續(xù)固定 2-3 天，觀察至標(biāo)本脫水硬化。

4、軟骨染色：將標(biāo)本浸泡于軟骨染色液中，觀察至肋骨、脊柱、尾骨處軟骨呈現(xiàn)藍(lán)色,取出,使用 70%酒精溶液反復(fù)進(jìn)行清洗，直至沖洗液顏色無(wú)色，梯度酒精復(fù)水。

5、消化加預(yù)透明:標(biāo)本放入消化液中，使肌肉顏色變淺，時(shí)間控制在一小時(shí)以內(nèi)，以防過(guò)度脫色軟化，放入 1%KOH 中進(jìn)行預(yù)透明，觀察至肌肉變軟透明，呈果凍狀，取出。

6、硬骨染色：將標(biāo)本浸泡于硬骨染色液中，每十五分鐘觀察一次，觀察至顱骨，足趾部，脊柱處硬骨呈現(xiàn)深紅色，取出。

7、脫色：：將染色后的標(biāo)本浸泡于 2%的 KOH 溶液中 8-12 小時(shí)，再浸泡于 1.5%的 KOH 溶液中 12-24 小時(shí)，最后浸泡于 1%的 KOH 溶液中 2-3 天，觀察至肌肉顏色變?yōu)闊o(wú)色呈果凍狀，骨組織變?yōu)榧t色，取出。

8、梯度透明：將標(biāo)本依次浸泡于 1%的 KOH 溶液與丙三醇所形成的梯度溶液,配比比例分別為： 1：4、2：3、3：2、4：1，標(biāo)本在梯度溶液中浸泡的時(shí)間為 1-2 天。，每次均以標(biāo)本沉入梯度溶液底部為準(zhǔn)，最后置于純甘油中進(jìn)行密封保存。

結(jié)果判讀：

標(biāo)本無(wú)多余肌肉且肌肉透明無(wú)色，骨骼完整，硬軟骨染色區(qū)分明顯。

注意事項(xiàng)：

1． 剝離皮膚時(shí)保證骨骼完整性，尤其是腕、踝部；

2． 采用試管進(jìn)行梯度透明，更方便觀察透明程度。

3. 標(biāo)本較多時(shí)防止染色液濃度變小，需定時(shí)對(duì)染色液進(jìn)行替換。